技術簡介
m5C RNA是近年來發現的一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C普遍存在，但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統性報道。云序生物率先開展m5C RNA甲基化測序服務，采用經典重亞硫酸鹽處理的方式進行測序（Bisulfite Sequencing, 簡稱 Bis-seq）。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。此外，云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序（m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing，簡稱 m5C MeRIP-seq）服務，助力 m5C 修飾研究。

 云序生物（m5C）RNA甲基化測序流程

云序生物RNA甲基化測序產品

云序優勢

一站式服務：
客戶只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA，云序生物為您完成m5C RNA-Seq全套實驗服務。
嚴格的質控：
云序生物對m5C RNA-Seq實驗每一步驟均設有關鍵質控，保證客戶得到優 質數據。
專業的生物信息學分析：
云序生物擁有專業的生物信息分析團隊，幫助客戶進行實驗數據的全 面挖掘。

樣本要求
樣品類型：
細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類型樣品請詳詢。
樣品量：

a) 細胞：2×10⁷ 

b) 組織：100 mg-1 g

c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）

樣品運輸與保存
樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數據分析（下列有※表示個性化分析）
1、識別RNA甲基化位點
通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域。

2、RNA甲基化位點的注釋※
富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

3、RNA甲基化位點在基因組中的分布※
根據注釋信息，繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

4、RNA甲基化位點Motif分析※
RNA上甲基化的位點，可能包含某種序列 motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif 特異性進行甲基化修飾，從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后，獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif，從而揭示 RNA甲基化修飾的機制。

5、差異RNA甲基化位點的識別與注釋
云序生物使用meRanCompare軟件識別兩個/組樣品間的差異甲基化位點，以FDR<0.01作為閾值，具體的以測序報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區，發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

6、差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析
對差異甲基化基因進行功能分類，并發現明顯富集的功能條目。

案例解析：

案例1：DNA修飾酶Tet2影響Socs3分子發生m5C RNA甲基化并參與機體免疫反應的過程

原文：Tet2 promotes pathogen infection-induced myelopoiesis through mRNA oxidation
期刊：Nature 影響因子：41.58

免疫學重點實驗室院士曹雪濤團隊發現DNA修飾酶Tet2分子可以通過調控RNA修飾的方式促進機體增加天然免疫細胞的數量和功能，以應對病原體感 染及其炎癥反應。在本文中，作者發現Tet2酶能夠直接結合免疫信號通路負調控分子Socs3的mRNA的3-UTR，并抑 制該區域m5C RNA甲基化。通過功能實驗，驗證發現此過程還需要與adar1結合，促進Socs3 mRNA形成dsRNA或發卡結構，引起Socs3被降解，在機體早期感 染天然免疫細胞的發生及功能發揮作用。

圖1. Tet2影響Scocs2發生m5C RNA甲基化機制圖