技術簡介

m6A RNA甲基化整體水平鑒定

N6-methyladenosine (m6A)，是一種腺嘌呤核苷酸在腺苷酸甲基轉移酶催化下發生的修飾，普遍的分布于不同類型的RNA中。眾所周知，RNA甲基化在RNA的可變剪切、轉錄起始和翻譯中發揮重要作用。RNA甲基化水平與新陳代謝﹑遺傳發育﹑疾病發生 發展等生物學過程密切相關。

云序生物優勢

(1) 靈敏高：

起始RNA量低至100 ng；

(2) 特異性高：

嚴格設置的陽性/陰性對照，結果更加準確可信；

(3) 穩定性高：

背景信號極低，結果更加簡單穩定；

(4) 速度快：

比色分析，方便和快速；

實驗原理

比色法RNA甲基化定量檢測試劑盒提供了定量檢測總RNA甲基化水平的試劑。采用類似ELISA抑 制競爭免疫的方法，實驗樣本和RNA甲基化標準品與RNA甲基化抗體共孵育；然后轉移到包被有RNA甲基化多核苷酸的條孔上。在孵育之后孔可以洗脫任何未包被的試劑然后添加檢測抗體生成信號，通過微孔板讀取儀（例：酶標儀）來檢測。因為在樣本的RNA甲基化抑 制了RNA甲基化抗體與涂抹在孔上RNA甲基化的結合，樣本中更高濃度導致與在孔中的RNA甲基化結合減少。因此，從孔中測得信號或OD參數與樣本中RNA甲基化的數量成反比。并且樣本中RNA甲基化的量可以通過預先設定的RNA甲基化標準品來實現定量檢測。

實驗步驟

圖注：RNA甲基化定量檢測試劑盒（比色法）操作步驟

實例展示

使用尿液樣本m6A定量檢測試劑盒(比色法)來定量人類尿液不同體積中m6A的含量。

樣本要求

樣品類型

組織、細胞、體液、總RNA。其它類型樣品請詳詢。

樣品量

a) 細胞：2×10⁶ 

b) 組織：50-100 mg

c) 體液：全血 1 mL, 血清、血漿 2 mL

腦脊液：3 mL

尿液：20 mL

d) 總RNA：1 μg (OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.5; 無明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無明顯彌散或拖尾)

樣品運輸及保存

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存;血液樣品應使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

參考文獻

1. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 期刊：Cancer Cell 影響因子：22.84

2. METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing  期刊：Hepatology 影響因子：14.08