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      m5C全轉錄組測序

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      m5C RNA是近年來發現的一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C存在,但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統性報道。云序生物率先開展m5C RNA甲基化測序服務,采用經典重亞硫 酸鹽處理的方式進行測序。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。
      技術詳情

      技術簡介
      m5C RNA是近年來發現的一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C存在,但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統性報道。云序生物率先開展m5C RNA甲基化測序服務,采用經典重亞硫酸鹽處理的方式進行測序(Bisulfite Sequencing, 簡稱 Bis-seq)。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。此外,云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序(m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing,簡稱 m5C MeRIP-seq)服務,助力 m5C 修飾研究。

      云序生物(m5C)RNA甲基化測序流程

       云序生物(m5C)RNA甲基化測序流程


      云序生物RNA甲基化測序產品

      云序生物RNA甲基化測序產品

      云序優勢

      一站式服務:
      客戶只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA,云序生物為您完成m5C RNA-Seq全套實驗服務。
      嚴格的質控:
      云序生物對m5C RNA-Seq實驗每一步驟均設有關鍵質控,保證客戶得到高質量質數據。
      專業的生物信息學分析:
      云序生物擁有專業的生物信息分析團隊,幫助客戶進行實驗數據的挖掘。

      樣本要求
      樣品類型:
      細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類型樣品請詳詢。
      樣品量:

      a) 細胞:2×107 

      b) 組織:100 mg-1 g

      c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)


      樣品運輸與保存
      樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
      樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


      數據分析(下列有※表示個性化分析)
      1、識別RNA甲基化位點
      通過高通量測序和生物信息分析,識別甲基化富集的基因組區域。

      識別RNA甲基化位點


      2、RNA甲基化位點的注釋
      富集峰識別后,得到的是一堆基因組位置信息,通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

      RNA甲基化位點的注釋


      3、RNA甲基化位點在基因組中的分布
      根據注釋信息,繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

          RNA甲基化位點在基因組中的分布          RNA甲基化位點在基因組中的分布


      4、RNA甲基化位點Motif分析
      RNA上甲基化的位點,可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif 特異性進行甲基化修飾,從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后,獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif,從而揭示 RNA甲基化修飾的機制。

      RNA甲基化位點Motif分析


      5、差異RNA甲基化位點的識別與注釋
      云序生物使用meRanCompare軟件識別兩個/組樣品間的差異甲基化位點,以FDR<0.01作為閾值,具體的以測序報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區,發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

      差異RNA甲基化位點的識別與注釋


      6、差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析
      對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目。

      差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析

      案例解析
      案例1:m5C RNA甲基化調控mRNA出核新機制

      原文:5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

      期刊:Cell Research 影響因子:15.60

      中科院汪海林等研究團隊揭示了m5C修飾在mRNA的分布圖譜規律及其對調控mRNA出核作用新機制。研究人員建立了改進的RNA m5C單堿基分辨率高通量測序與生物信息分析技術,以此揭示mRNA m5C的分布規律,并繪制了精細的m5C修飾圖譜,發現m5C在mRNA的翻譯起始位點下游有明顯富集,并且主要分布于CG富集區域。通過分析對比人和小鼠不同組織,發現m5C在mRNA上的分布特征在哺乳動物中十分保守,而在不同組織中修飾的基因具有特異性。研究團隊同時發現,在小鼠睪丸發育過程中,動態的m5C修飾基因明顯富集于精子發育相關功能,提示m5C修飾參與生殖發育調控。


      mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

      圖1. mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達


      案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜

      原文:Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

      期刊:Genome Biology 影響因子:13.21

      近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞(ESC)和腦組織(n=3)作為實驗樣本,利用m5C RNA甲基化測序技術對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進行檢測。結果表明,ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點和不同的基因組區域(CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等)進行了關聯分析。結果表明,總RNA中m5C位點更傾向于分布在轉錄起始位點。腦組織和ESC中,3’-UTR區m5C的分布區別很大,這暗示著3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類型密切相關。


      m5C的基因組位置分布

      圖2. m5C的基因組位置分布


      案例3:擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響

      原文:Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

      期刊:The Plant Cell 影響因子:8.23

      與上篇不同,本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜,在種子,幼芽,根中發現了1000多個特異性的位點。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B,造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實TRM4B突變體的初級根比野生型更短,同時對氧化的應激反應更敏感。


      擬南芥種子,幼芽,根中m5C位點

      圖3. 擬南芥種子,幼芽,根中m5C位點


      m5C全轉錄組測序
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      m5C RNA是近年來發現的一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C存在,但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統性報道。云序生物率先開展m5C RNA甲基化測序服務,采用經典重亞硫酸鹽處理的方式進行測序(Bisulfite Sequencing, 簡稱 Bis-seq)。在全轉錄范圍內及tRNA水平查看基因m5C甲基化修飾水平。此外,云序生物亦提供 m5C 甲基化免疫沉淀測序(m5C Methylation Immunoprecipitation Sequencing,簡稱 m5C MeRIP-seq)服務,助力 m5C 修飾研究。

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      樣本要求
      樣品類型:
      細胞、新鮮組織或RNA樣品。其它類型樣品請詳詢。
      樣品量:

      a) 細胞:2×107 

      b) 組織:100 mg-1 g

      c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)


      樣品運輸與保存
      樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
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      數據分析(下列有※表示個性化分析)
      1、識別RNA甲基化位點
      通過高通量測序和生物信息分析,識別甲基化富集的基因組區域。

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      2、RNA甲基化位點的注釋
      富集峰識別后,得到的是一堆基因組位置信息,通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

      RNA甲基化位點的注釋


      3、RNA甲基化位點在基因組中的分布
      根據注釋信息,繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

          RNA甲基化位點在基因組中的分布          RNA甲基化位點在基因組中的分布


      4、RNA甲基化位點Motif分析
      RNA上甲基化的位點,可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif 特異性進行甲基化修飾,從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后,獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif,從而揭示 RNA甲基化修飾的機制。

      RNA甲基化位點Motif分析


      5、差異RNA甲基化位點的識別與注釋
      云序生物使用meRanCompare軟件識別兩個/組樣品間的差異甲基化位點,以FDR<0.01作為閾值,具體的以測序報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區,發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

      差異RNA甲基化位點的識別與注釋


      6、差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析
      對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目。

      差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析差異RNA甲基化位點的GO與信號通路分析

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      原文:5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader

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      mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達

      圖1. mRNA中m5C的分布規律及組織特異性表達


      案例2: m5C RNA甲基化基因組分布圖譜

      原文:Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain 

      期刊:Genome Biology 影響因子:13.21

      近期刊登了解析RNA m5C在不同組織細胞的分布圖譜相關文章。研究人員選取小鼠胚胎干細胞(ESC)和腦組織(n=3)作為實驗樣本,利用m5C RNA甲基化測序技術對兩組樣本中的總RNA和胞核RNA進行檢測。結果表明,ESC中總RNA 5mC的分布頻率比腦組織的分布頻率更高。研究人員將m5C位點和不同的基因組區域(CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等)進行了關聯分析。結果表明,總RNA中m5C位點更傾向于分布在轉錄起始位點。腦組織和ESC中,3’-UTR區m5C的分布區別很大,這暗示著3’-UTR區的RNA m5C修飾可能與細胞功能和細胞類型密切相關。


      m5C的基因組位置分布

      圖2. m5C的基因組位置分布


      案例3:擬南芥m5C RNA甲基化譜及TRM4B酶對根的影響

      原文:Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs

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      與上篇不同,本研究團隊采用m5C RNA甲基化測序研究擬南芥中m5C甲基化譜,在種子,幼芽,根中發現了1000多個特異性的位點。敲低RNA m5C甲基轉移酶TRM4B,造成tRNA穩定性的降低。研究人員還證實TRM4B突變體的初級根比野生型更短,同時對氧化的應激反應更敏感。


      擬南芥種子,幼芽,根中m5C位點

      圖3. 擬南芥種子,幼芽,根中m5C位點


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