技術簡介

近年來，科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發生甲基化修飾(N6-methyladenosine，m6A)。研究發現，m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾，m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯，以及在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。種種研究跡象表明m6A 存在于很多物種中，占到了 RNA甲基化修飾的80%。m6A除了分布在 mRNA 中，也出現在很多非編碼 RNA中 ，如：環狀RNA 、LncRNA等。Nature正刊發表文章，證實發生m6A RNA甲基化修飾可以調控mRNA穩定性。而隨后Cell Research也發表文章，證實環狀RNA也會被m6A甲基化修飾，并會促進環狀RNA編碼蛋白這一有趣的結論。云序生物提供 m6A 甲基化免疫沉淀測序（m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing，簡稱 m6A MeRIP-seq）服務，助力 m6A 修飾研究。

?? 云序生物(m6A)RNA甲基化測序流程

云序生物RNA甲基化測序產品

云序優勢

一站式服務：

客戶只需提供細胞、組織或RNA，云序生物為您完成從MeRIP富集，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。

優化的實驗流程

MeRIP的富集效率是決定數據質量的關鍵，云序生物MeRIP實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程，具有極高的效率和特異性。

嚴格的質控

云序生物對MeRIP實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控，全程監控實驗質量，確?？蛻舻玫絻?質的數據。

專業的生物信息學分析

云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。

特異性高

通過抗體特異性富集發生甲基化修飾的RNA片段，以較低的成本實現轉錄組范圍的RNA甲基化研究。

樣本要求：

樣品類型：

細胞、組織或RNA，其他樣本類型請電詢。

樣品量：

a) 細胞：2×10⁷ 

b) 組織：100 mg-1 g

c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）

樣品運輸及保存：

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心f管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存; RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數據分析（下列有※表示個性化分析）

1. 識別甲基化富集峰

通過高通量測序和生物信息分析，識別(p <10^-5)甲基化富集的基因組區域。

             

注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率

2. RNA甲基富集峰注釋※

通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

3. RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布※

根據注釋信息，繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。

4. RNA甲基化位點Motif分析※

RNA上甲基化的位點，可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些motif特異性進行甲基化修飾，從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后，獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些motif，從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

5. 差異RNA甲基化區域的識別與聚類※

云序生物使用 diffReps 軟件進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05，具體以報告為準。 識別樣本間的差異甲基化區，發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

6. 差異甲基化區的GO與信號通路分析

對差異甲基化基因進行功能分類，并發現明顯富集的功能條目。

7. Reads 的分布※

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位點的分布情況，可以用來觀察 RNA 甲基化對TSS 等位點是否有偏好。

案例分析

案例1：擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜

原文：Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

期刊：Genome Biology 影響因子：13.21

西北農林科技大學聯合中科院和普渡大學，借助m6A RNA甲基化測序技術，對比擬南芥花，葉，根組織中（每種組織有兩個生物學重復）m6A RNA甲基化情況。結果發現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類高10%左右，占轉錄組的83%。

圖1. 比較擬南芥花，葉，根組織中m6A RNA甲基化情況

案例2：不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜 

原文：Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

期刊：Nature communications 影響因子：12.12

芝加哥大學聯合北大，利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜，發現的分布在兩個品種間高度保守。與人類m6A RNA甲基化位點分布情況相比，擬南芥甲基化位點在起始翻譯區特異性高表達。

圖2. 不同品系，同一基因上甲基化 

案例3：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合lncRNA促進膠質瘤細胞

原文：m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

期刊：Cancer Cell 影響因子：27.43 

世界衛生組織將膠質瘤分為四級，其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級，手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來，m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一，不斷有高影響因子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰，此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調，而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5，meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式，基因芯片檢測差異表達>2倍的基因，篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因，其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化，增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用，發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。 

             圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用，促進惡性膠質瘤腫 瘤形成