技術簡介
近年來，科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾（N6-methyladenosine，m6A）。研究發現，m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾， m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯，在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。云序生物提供 m6A 甲基化免疫沉淀測序（m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing，簡稱 m6A MeRIP-seq）服務，助力 m6A 修飾研究。目前對m6A RNA流行檢測手段為MeRIP-Seq技術，云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服務，技術原理如下： 將甲基化RNA特異性抗體與被隨機打斷的RNA片段進行共孵育，抓取有甲基化修飾的片段進行測序；同時需要平行測序一個對照（Input）樣本，對照樣本只含有打斷的RNA片段，并不添加RNA甲基化特異性抗體與其共孵育。對照樣本用于消除非特異性抓取甲基化片段的背景。對比免疫共沉淀(IP)樣本和對照樣本（Input）中的序列片段，將RNA甲基化修飾位點定位到轉錄組上，并根據RNA-seq數據，計算樣本中RNA甲基化程度。

云序生物RNA甲基化測序產品

云序優勢
一站式服務
客戶只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA，云序生物為您完成從m6A RNA-seq富集，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優化的實驗流程
m6A RNA-seq的富集效率是決定數據質量的關鍵，云序生物m6A RNA-seq實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程，具有極高的效率和特異性。
嚴格的質控
云序生物對m6A RNA-seq實驗每一步驟均設有關鍵質控，全程監控實驗質量，保證客戶得到優 質數據。
專業的生物信息學分析
云序生物擁有專業的生物信息分析團隊，幫助客戶進行實驗數據的全 面挖掘。
RNA甲基化測序與轉錄組聯合應用
可整合RNA甲基化數據和轉錄組數據進行生物信息學關聯分析，揭示RNA甲基化對基因表達調控的影響，深入挖掘RNA甲基化的功能。

樣品要求

樣品類型
細胞、組織或RNA，其他樣本類型請電詢。
樣品量

a) 細胞：2×10⁷ 

b) 組織：100 mg-1 g

c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）

樣品運輸與保存
樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數據分析（下列有※表示個性化分析）
1、識別甲基化富集峰
通過高通量測序和生物信息分析，識別（p <10^-5）甲基化富集的基因組區域。
注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率

2、RNA甲基富集峰注釋※
通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

3、RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布 ※

根據注釋信息，繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。   

4、RNA甲基化位點Motif分析※
RNA上甲基化的位點，可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif特異性進行甲基化修飾，從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后，獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif，從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

5、差異RNA甲基化區域的識別與聚類※
云序生物使用 diffReps 包進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05，具體以報告為準。識別樣本間的差異甲基化區，發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

6、差異甲基化區的GO與信號通路分析
對差異甲基化基因進行功能分類，并發現明顯富集的功能條目。

7、Reads 的分布※
使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位點的分布情況，可以用來觀察 RNA 甲基化對 TSS 等位點是否有偏好。

案例解析

案例1：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合LncRNA促進膠質瘤細胞增殖

原文：The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program

期刊：Cancer Cell 影響因子：27.43

世界衛生組織將膠質瘤分為四級，其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級，手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來，m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一，不斷有高影響因子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰，此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調，而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5，meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式，基因芯片檢測差異表達>2倍的基因，篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因，其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化，增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用，發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。

 圖1. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用，促進惡性膠質瘤腫 瘤形成

案例2. lincRNA 1281上的m6A 甲基化影響細胞分化

原文：N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential

期刊：Nucleic Acids Research 影響因子：11.56

同濟大學康九紅團隊研究發現在mESC細胞中，甲基化轉移酶Mettl3能夠調控lincRNA 1281發生甲基化，并且與干細胞分化能力直接相關。揭示此過程主要發生在胞漿，且由let-7能夠競爭性結合linc1281，從而降低其表達量，從機制上解釋了m6A在不影響到表達水平的情況下如何影響生物學功能的問題。

圖2.敲降Mettl3能夠影響linc1281的甲基化

圖3.熒光報告素酶實驗共轉染linc1281與miRNA mimics