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      m6A LncRNA測序

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      m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾, m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。目前對m6A RNA流行檢測手段為MeRIP-Seq技術,云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服務,
      技術詳情

      技術簡介
      近年來,科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發現,m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾, m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。云序生物提供 m6A 甲基化免疫沉淀測序(m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing,簡稱 m6A MeRIP-seq)服務,助力 m6A 修飾研究。目前對m6A RNA流行檢測手段為MeRIP-Seq技術,云序生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服務,技術原理如下: 將甲基化RNA特異性抗體與被隨機打斷的RNA片段進行共孵育,抓取有甲基化修飾的片段進行測序;同時需要平行測序一個對照(Input)樣本,對照樣本只含有打斷的RNA片段,并不添加RNA甲基化特異性抗體與其共孵育。對照樣本用于消除非特異性抓取甲基化片段的背景。對比免疫共沉淀(IP)樣本和對照樣本(Input)中的序列片段,將RNA甲基化修飾位點定位到轉錄組上,并根據RNA-seq數據,計算樣本中RNA甲基化程度。

      云序生物m6A RNA-seq實驗流程
       云序生物m6A RNA-seq實驗流程

      云序生物RNA甲基化測序產品

      云序生物RNA甲基化測序產品

      云序優勢
      一站式服務
      客戶只需提供組織、細胞、體液樣品或RNA,云序生物為您完成從m6A RNA-seq富集,文庫制備,上機測序到數據分析整套服務流程。
      優化的實驗流程
      m6A RNA-seq的富集效率是決定數據質量的關鍵,云序生物m6A RNA-seq實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程,具有極高的效率和特異性。
      嚴格的質控
      云序生物對m6A RNA-seq實驗每一步驟均設有關鍵質控,全程監控實驗質量,保證客戶得到優 質數據。
      專業的生物信息學分析
      云序生物擁有專業的生物信息分析團隊,幫助客戶進行實驗數據的全 面挖掘。
      RNA甲基化測序與轉錄組聯合應用
      可整合RNA甲基化數據和轉錄組數據進行生物信息學關聯分析,揭示RNA甲基化對基因表達調控的影響,深入挖掘RNA甲基化的功能。

      樣品要求

      樣品類型
      細胞、組織或RNA,其他樣本類型請電詢。
      樣品量

      a) 細胞:2×107 

      b) 組織:100 mg-1 g

      c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)

      樣品運輸與保存
      樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
      樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


      數據分析(下列有※表示個性化分析)
      1、識別甲基化富集峰
      通過高通量測序和生物信息分析,識別(p <10-5)甲基化富集的基因組區域。
      注:每個樣品組做一個Input,以去除基因組背景,降低假陽性率


      識別甲基化富集峰


      2、RNA甲基富集峰注釋
      通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

      RNA甲基富集峰注釋


      3、RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布 

      根據注釋信息,繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。   

      RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布


      4、RNA甲基化位點Motif分析
      RNA上甲基化的位點,可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif特異性進行甲基化修飾,從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后,獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif,從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

      RNA甲基化位點Motif分析

      5、差異RNA甲基化區域的識別與聚類
      云序生物使用 diffReps 包進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05,具體以報告為準。識別樣本間的差異甲基化區,發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

      差異RNA甲基化區域的識別與聚類

      6、差異甲基化區的GO與信號通路分析
      對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目。


      差異甲基化區的GO與信號通路分析


      7、Reads 的分布
      使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS, genebody, TES 等位點的分布情況,可以用來觀察 RNA 甲基化對 TSS 等位點是否有偏好。

      Reads 的分布

      案例解析

      案例1:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合LncRNA促進膠質瘤細胞增殖

      原文:The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program

      期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43

      世界衛生組織將膠質瘤分為四級,其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來,m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一,不斷有高影響因子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰,此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。

      ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫瘤形成

       圖1. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫 瘤形成


      案例2. lincRNA 1281上的m6A 甲基化影響細胞分化

      原文:N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential

      期刊:Nucleic Acids Research 影響因子:11.56

      同濟大學康九紅團隊研究發現在mESC細胞中,甲基化轉移酶Mettl3能夠調控lincRNA 1281發生甲基化,并且與干細胞分化能力直接相關。揭示此過程主要發生在胞漿,且由let-7能夠競爭性結合linc1281,從而降低其表達量,從機制上解釋了m6A在不影響到表達水平的情況下如何影響生物學功能的問題。


      敲降Mettl3能夠影響linc1281的甲基化

      圖2.敲降Mettl3能夠影響linc1281的甲基化


      熒光報告素酶實驗共轉染linc1281與miRNA mimics

      圖3.熒光報告素酶實驗共轉染linc1281與miRNA mimics


      m6A LncRNA測序
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      專業的生物信息學分析
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      RNA甲基化測序與轉錄組聯合應用
      可整合RNA甲基化數據和轉錄組數據進行生物信息學關聯分析,揭示RNA甲基化對基因表達調控的影響,深入挖掘RNA甲基化的功能。

      樣品要求

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      細胞、組織或RNA,其他樣本類型請電詢。
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      a) 細胞:2×107 

      b) 組織:100 mg-1 g

      c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)

      樣品運輸與保存
      樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
      樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。


      數據分析(下列有※表示個性化分析)
      1、識別甲基化富集峰
      通過高通量測序和生物信息分析,識別(p <10-5)甲基化富集的基因組區域。
      注:每個樣品組做一個Input,以去除基因組背景,降低假陽性率


      識別甲基化富集峰


      2、RNA甲基富集峰注釋
      通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋,并根據峰中點相對于已知基因的位置,將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。

      RNA甲基富集峰注釋


      3、RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布 

      根據注釋信息,繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。   

      RNA甲基化富集峰區域的在基因組中的分布


      4、RNA甲基化位點Motif分析
      RNA上甲基化的位點,可能包含某種序列motif。RNA甲基化酶可能正是通過識別這些 motif特異性進行甲基化修飾,從而完成轉錄后調控功能。我們成功識別了全基因組的RNA上的甲基化位點后,獲取序列就能使用生物信息學的手段來搜索這些 motif,從而揭示RNA甲基化修飾的機制。

      RNA甲基化位點Motif分析

      5、差異RNA甲基化區域的識別與聚類
      云序生物使用 diffReps 包進行差異甲基化位點的識別。默認篩選標準為 FDR<=0.05,具體以報告為準。識別樣本間的差異甲基化區,發現與特定表型或疾病相關的甲基化區域。

      差異RNA甲基化區域的識別與聚類

      6、差異甲基化區的GO與信號通路分析
      對差異甲基化基因進行功能分類,并發現明顯富集的功能條目。


      差異甲基化區的GO與信號通路分析


      7、Reads 的分布
      使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS, genebody, TES 等位點的分布情況,可以用來觀察 RNA 甲基化對 TSS 等位點是否有偏好。

      Reads 的分布

      案例解析

      案例1:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合LncRNA促進膠質瘤細胞增殖

      原文:The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program

      期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43

      世界衛生組織將膠質瘤分為四級,其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來,m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一,不斷有高影響因子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰,此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。

      ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫瘤形成

       圖1. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫 瘤形成


      案例2. lincRNA 1281上的m6A 甲基化影響細胞分化

      原文:N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential

      期刊:Nucleic Acids Research 影響因子:11.56

      同濟大學康九紅團隊研究發現在mESC細胞中,甲基化轉移酶Mettl3能夠調控lincRNA 1281發生甲基化,并且與干細胞分化能力直接相關。揭示此過程主要發生在胞漿,且由let-7能夠競爭性結合linc1281,從而降低其表達量,從機制上解釋了m6A在不影響到表達水平的情況下如何影響生物學功能的問題。


      敲降Mettl3能夠影響linc1281的甲基化

      圖2.敲降Mettl3能夠影響linc1281的甲基化


      熒光報告素酶實驗共轉染linc1281與miRNA mimics

      圖3.熒光報告素酶實驗共轉染linc1281與miRNA mimics


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