云序用戶農口IF20+論文：植物mRNA存在ac4C新型修飾，對RNA穩定性及翻譯產生重要影響

云序生物客戶湖南大學何崇圣課題組通過LC-MS 、 acRIP-seq 以及翻譯組學研究實驗等手段，證明了在雙子葉植物代表物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）和單子葉植物代表物種水稻（Oryza sativa）當中 mRNA 上 ac4C 乙?；揎椀钠毡榇嬖?，并探討了其在 RNA 穩定性、RNA 可變剪接、蛋白翻譯以及 RNA 空間結構方面的調控作用。云序生物有幸參與了其中LC-MS 以及 acRIP-seq 實驗。

N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）是一種高度保守的RNA修飾，廣泛存在于細菌、酵母和人類的tRNA和rRNA中。近年的一些研究表明，ac4C修飾同樣存在于mRNA上，是一種新型的mRNA修飾。即使是在嗜熱古菌（Hyperthermophilic archaea）和艾滋病毒（HIV-1）這樣的特殊物種當中也都發現了ac4C修飾，起到調控嗜熱古菌對極端高溫環境的適應以及調控艾滋病毒復制的作用。然而，在植物當中，ac4C修飾是否存在于mRNA上仍存在爭議。云序生物客戶湖南大學何崇圣課題組通過LC-MS 、 acRIP-seq 以及翻譯組學研究實驗等手段，證明了在雙子葉植物代表物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）和單子葉植物代表物種水稻（Oryza sativa）當中 mRNA 上 ac4C 乙?；揎椀钠毡榇嬖?，并探討了其在 RNA 穩定性、RNA 可變剪接、蛋白翻譯以及 RNA 空間結構方面的調控作用。云序生物有幸參與了其中LC-MS 以及 acRIP-seq 實驗。

論文標題：Transcriptome-wide profiling of RNA N4-cytidine acetylation in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
發表日期：2023年04月12日
發表期刊：Molecular Plant
影響因子：21.949
研究方法：LC-MS/MS檢測核酸修飾水平、acRIP-seq 等

研究思路圖

1、擬南芥和水稻的 mRNA 上存在 ac4C 修飾
首先，作者使用 ac4C dot blot 實驗證明了擬南芥和水稻幼苗當中存在與人類 Hela 細胞當中相當水平的 ac4C RNA 修飾，且豐富隨著發育時間存在動態變化。隨后，作者使用LC-MS 再度檢測了擬南芥和水稻幼苗當中提取的總 RNA 和 mRNA，其中擬南芥總 RNA 中有 0.6% 的 ac4C/C% 占比，mRNA 中有 0.4% 的 ac4C/C% 占比；水稻總 RNA 中有 0.6% 的 ac4C/C% 占比，mRNA 中有 0.3% 的 ac4C/C% 占比。這些發現證實擬南芥和水稻當中普遍存在的 ac4C RNA 修飾，并且這種修飾不僅位于非編碼 RNA 上，而是在 mRNA 上亦廣泛存在。

2、選用 acRIP-seq 技術進行后續研究
為了高通量地研究 RNA 上的 ac4C 乙?；揎?，存在多種不同的實驗方法，包括使用 ac4C 抗體富集的 acRIP-seq方法（Acetylated RNA Immunoprecipitation Sequencing），以及使用化學試劑處理引發 ac4C 到 T突變的 ac4C-seq。為了驗證兩種方法的效果，作者設計了一段帶有單個 ac4C 修飾位點的體外轉錄本（in vitro transcript，記作“IVT”），將其摻入植物樣品來源的 RNA 中當作外參。當 IVT 與植物總 RNA 比例為 1：1 時，acRIP-seq 和 ac4C-seq 兩種測序方法都可以有效檢出 IVT 上的 ac4C 修飾。然而，當 IVT 與植物總 RNA 比例為 1：5000 時，ac4C-seq 無法檢出 IVT 當中的 ac4C 修飾，只有 acRIP-seq 在 1：5000 的低濃度時仍然能檢測到 IVT 上的 ac4C 修飾?？紤]到生物體內 ac4C 的發生比例較低，需要靈敏檢出低豐度的 ac4C 修飾，因此作者后續與云序生物合作，采用了 acRIP-seq 作為 RNA 樣品乙?；揎椄咄繙y序的方法。

3、擬南芥和水稻的 ac4C 乙?；V
通過 acRIP-seq，作者在外源的 IVT 以及內源的 rRNA 上都檢測到了理論預測要出現的 ac4C 峰，證明該實驗方法的可靠性。acRIP-seq 結果顯示，ac4C 修飾廣泛分布在擬南芥和水稻的整個基因組的各個染色體上。

無論是擬南芥還是水稻，其 ac4C 乙?；宥技蟹植加谄鹗济艽a子附近，亦在整個 CDS 區具有較高豐度。該現象與早前在哺乳動物當中報道過的 ac4C 修飾分布情況類似，暗示可能存在進化上的保守性。無論是擬南芥還是水稻，單個轉錄本上的 ac4C 峰個數都存在遞減現象。

4、擬南芥和水稻 ac4C 修飾基因的比較
為了研究植物中RNA ac4C修飾的進化保守性和潛在功能，作者比較了擬南芥和水稻中ac 4C的修飾基因。GO 分析顯示，擬南芥和水稻當中的 ac4C 修飾基因具有一定的相似性，重復出現的 GO 條目包括核糖體生物發生（ribosome biogenesis）、光合作用（photosynthesis）、糖酵解（glycolytic process）以及對植物激素的反應（response to phytohormone）等。擬南芥的 ac4C 修飾基因特有富集的 GO 條目與RNA結合（RNA binding）以及應激反應（stress response）有關，而水稻 ac4C 修飾基因特有富集的 GO 條目則與翻譯（translation）活動相關。在擬南芥的 2160 個 ac4C 乙?；虍斨?，有 1574 個在水稻當中存在同源基因；而在水稻的 3824 個 ac4C 乙?；虍斨?，有 2619 個在擬南芥中存在同源基因。有多達 634 個 ac4C 乙?；蛟跀M南芥和水稻當中同時被檢測到，其中有一個編碼超氧化物歧化酶的基因，在擬南芥當中未 AtSOD2，在水稻當中的同源基因為 OsSOD4，它們的起始密碼子附近都有檢測到一個非常明顯的 ac4C 乙?；?。此外，也存在一些物種特異性的 ac4C 乙?；?，例如擬南芥當中的 PIN3 基因和水稻中的 OsIAA21 基因。

根據以往的報道，在哺乳動物當中，RNA 的 ac4C 乙?；揎椏赡艽嬖诠餐幕颍╩otif）特征。為了探明在植物當中是否也存在 ac4C 特征 motif，作者對擬南芥和水稻進行了 ac4C motif 分析，結果發現：在擬南芥當中，HYCHYCWYCWYC 和 CUUCUUCYUCYU 是最常見的 RNA ac4C 乙?；?motif；而在水稻當中，CBHCAAGNHC、SVAGHHSUAC 和 CNNCNNCNNC 是最常見的 RNA ac4C 乙?；?motif。在擬南芥和水稻兩個物種之間，則存在 CCAA 這樣一個共有的 RNA ac4C 乙?；?motif。然而，在 UTR 區域，幾乎找不到共有的 motif 特征。綜上所述，作者認為植物的 RNA ac4C 乙?；揎椉创嬖诳缥锓N保守性，也存在一定的物種特異性。

根據以往的報道，在人類當中，RNA 的 ac4C 乙?；揎検?NAT10 酶的催化。為了探明植物當中 NAT10 的同源物，作者使用人類 NAT10 蛋白全長通過 BLAST 尋找其在擬南芥和水稻當中的同源蛋白。通過一系列后續實驗，作者證明了AtNAT10a 和 AtNAT10b 是擬南芥的 NAT10 同源蛋白，且這兩個基因的敲除在擬南芥中是致死的；而在水稻當中，NAT10 的同源蛋白是osNAT10，它調控水稻幼苗的發育，影響水稻穗（panicles）的數量，并最終影響到產量的提高。

5、植物 RNA ac4C 修飾的功能：增強 RNA 穩定性和調控可變剪接
根據以往已發表的文獻，作者發現 ac4C 修飾的 mRNA 擁有更長的半衰期。為了驗證這一結論是否在植物當中成立，作者在擬南芥和水稻當中使用轉錄抑制劑放線菌素D（actinomycin D）以抑制新 mRNA 的生成，并在此基礎上檢測原有 mRNA 的留存水平。在水稻當中，5 個 ac4C 修飾的基因 (Os05g0103400, Os02g0509500, OsSOD4, OsTMK 和 OsIAA21) 在野生型（WT）當中都比乙?；揎椧种菩停╫snat10-1）表現出更高的 mRNA 穩定性。在擬南芥當中，ac4C(+) 基因（AT1G09310 和 AT2G28190）亦表現出比 ac4C(-)基因（At1G69960 ，即 PP2A）更高的穩定性。為排除放線菌素D對 RNA 乙?；揎椀挠绊?，作者還進行了 ac4C dot blot 實驗，在放線菌素D處理組和 mock 組之間觀測到近似的 ac4C 修飾水平。綜上所述，作者認為 RNA 的ac4C 修飾提升了 mRNA 的穩定性。除此之外，作者亦通過其它一系列實驗證明了 RNA 的 ac4C 乙?；揎棿龠M了 RNA 的可變剪接，提供了更加豐富的可變剪接轉錄本類型。

6、植物 RNA ac4C 修飾的功能：促進翻譯和抑制空間結構
RNA 修飾除了可能影響轉錄本的穩定性和可變剪接以外，還可能影響到蛋白質的翻譯效率。作者通過 RNC-mRNA-seq 實驗發現，ac4C(+) 基因的翻譯效率要顯著高于 ac4C(-) 基因，且 UTR 區域發生 ac4C 修飾的基因的翻譯效率要顯著高于 CDS 區域發生 ac4C 修飾的基因。如果進一步細分 CDS 區域，將前 10% 定義為 “near 5’UTR”，將中間的 10% 定義為 “middle”，將后 10% 定義為 “near 3’UTR”，則“near 5’UTR”和“near 3’UTR”上發生 ac4C 修飾基因的翻譯效率要顯著高于“middle”類型。綜上所述，作者認為 UTR 區域以及 CDS 上接近 UTR 的區域上的 ac4C 乙?；揎棇⑵鸬教嵘g效率的作用。在野生型與乙?；揎椧种菩停╫snat10-1）之間比較可以發現，ac4C(+) 基因在野生型當中的翻譯效率要高于乙?；揎椧种菩?。作者挑選了兩個擬南芥的 ac4C 修飾基因（HIRD11 和 AT2G15960）和兩個水稻的 ac4C 修飾基因（Os05g0103400 和 Os02g0509500），發現其 ac4C(+) 修飾型轉錄本比 ac4C(-) 未修飾型轉錄本的蛋白表達量都要高，且在水稻當中的提升倍數比擬南芥中更大，暗示水稻中的 RNA ac4C 修飾與翻譯效率之間的關聯比在擬南芥中更強。除此之外，作者亦通過其它一系列實驗證明了 RNA 的 ac4C 乙?；揎椗c RNA 的空間結構之間存在負相關的關系，即 ac4C 乙?；揎椀?RNA 更傾向于擁有簡單的單鏈結構。

小結

作者通過 LC-MS 以及 acRIP-seq 等技術，在雙子葉植物代表物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）和單子葉植物代表物種水稻（Oryza sativa）當中的 mRNA 上 ac4C 乙?；揎椀钠毡榇嬖?，并揭示了其乙?；揎椬V的基本特征。本項研究發現，在擬南芥和水稻當中，RNA 的 ac4C 乙?；揎椏商岣?mRNA 穩定性，促進 RNA 可變剪接，提升蛋白翻譯效率，并減少 RNA 出現空間結構。該論文拓展了 RNA ac4C 乙?；揎椀奈锓N研究范圍，揭示了 RNA ac4C 乙?；揎椩陔p子葉植物和單子葉植物當中的普遍存在及其生物學功能。

云序生物ac4C修飾研究六大模塊

01 ac4C RNA修飾測序
ac4C RNA修飾測序
對ac4C RNA乙?；?，目前最流行的檢測手段為acRIP-seq技術，適用于ac4C RNA乙?；V研究，快速篩選ac4C RNA乙?；谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序：

ac4C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
ac4C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
ac4C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
ac4C mRNA測序
ac4C rRNA測序
ac4C circRNA測序
ac4C tRNA測序

02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
精準高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控ac4C RNA乙?；募谆D移酶。
04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證靶基因RNA修飾水平。
05 機制互作研究
RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
06 翻譯組
Ribo-seq（核糖體印記測序）
捕獲核糖體保護的 mRNA 片段，助力探索蛋白質合成的基因表達調控機制。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表百余篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子1000+, 其中RNA乙?；瘻y序有多達4篇影響因子接近20 分的高分論文。
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，全面覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供ac4C一站式服務：ac4C 整體水平檢測、acRIP-seq、acRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull down等。
優勢五：率先研發超微量 ac RIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。

云序客戶 acRIP-seq 項目論文